紅景天中的HMA3基因能編碼Cd轉(zhuǎn)運蛋白?？蒲腥藛T將紅景天中的HMA3基因轉(zhuǎn)入欒樹，以實現(xiàn)欒樹的定向改良，使其增強(qiáng)對Cd的富集能力，從而更有效治理Cd污染。實驗的主要流程如圖，其中Hyg^r為潮霉素抗性基因，Kan^r為卡拉霉素抗性基因。下表為限制酶的識別序列和切割位點。請回答下列問題。

EcoRⅠ	BamHⅠ	HindⅢ	Sau3AⅠ	BglⅡ	XbaⅠ
G↓AATTC	G↓GATCC	A↓AGCTT	↓GATC	A↓GATCT	T↓CTAGA

（1）重組質(zhì)粒的構(gòu)建、擴(kuò)增、保存：
①從紅景天細(xì)胞中提取總RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR，該過程需要加入的酶有

耐高溫的DNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶

耐高溫的DNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶

。PCR過程中在循環(huán)前常要進(jìn)行一次94℃、5min預(yù)變性，其目的是

增加模板DNA徹底變性的概率（使模板DNA充分變性）

增加模板DNA徹底變性的概率（使模板DNA充分變性）

。
②據(jù)以上圖表分析，為構(gòu)建Cd轉(zhuǎn)運蛋白與綠色熒光蛋白（GFP）的融合蛋白，進(jìn)行PCR擴(kuò)增HMA3基因時需要在引物的5′端添加限制酶

BglⅡ和HindⅢ

BglⅡ和HindⅢ

的識別序列，以確保目的基因與質(zhì)粒正確連接。至少需要

3

3

個循環(huán)才能獲得預(yù)期的基因。若模板HMA3基因的數(shù)量為a個，進(jìn)行35個循環(huán)后，產(chǎn)物中同時含有兩種引物的DNA有

（2³⁵-2）a

（2³⁵-2）a

個。
③通過DNA連接酶進(jìn)行連接制備重組質(zhì)粒，并依次轉(zhuǎn)入大腸桿菌和農(nóng)桿菌。其中將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌的主要目的是

讓其在大腸桿菌中復(fù)制、保存

讓其在大腸桿菌中復(fù)制、保存

（2）欒樹愈傷組織的誘導(dǎo)：
切割無菌苗將其莖段插入愈傷組織培養(yǎng)基，培養(yǎng)基應(yīng)添加

細(xì)胞分裂素和生長素

細(xì)胞分裂素和生長素

（填植物激素的名稱），放入培養(yǎng)箱，經(jīng)過21d的黑暗誘導(dǎo)，形成愈傷組織。
（3）農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系的建立：
將農(nóng)桿菌單克隆菌株對欒樹愈傷組織進(jìn)行侵染轉(zhuǎn)化，并用添加

潮霉素

潮霉素

的培養(yǎng)基篩選出轉(zhuǎn)化成功的愈傷組織，將愈傷組織繼續(xù)培養(yǎng)成完整植株。
（4）原生質(zhì)體制備及目的基因的檢測和鑒定：
①取4g篩選后愈傷組織，用鑷子輕輕搗碎，沖洗。用濾網(wǎng)過濾溶液，將愈傷組織轉(zhuǎn)移至含

纖維素酶和果膠酶

纖維素酶和果膠酶

的酶解液中處理一段時間獲得原生質(zhì)體。
②在激光共聚焦下觀測到細(xì)胞膜發(fā)出綠色熒光。在本研究中選擇GFP與Cd轉(zhuǎn)運蛋白構(gòu)建融合蛋白的目的是

通過觀察綠色熒光來確定Cd轉(zhuǎn)運蛋白是否表達(dá)以及分布場所

通過觀察綠色熒光來確定Cd轉(zhuǎn)運蛋白是否表達(dá)以及分布場所

?？茖W(xué)家們已通過蛋白質(zhì)工程技術(shù)制造出了藍(lán)色熒光蛋白，正確的順序是

②①③④

②①③④

（用下列序號表示）。
①推測藍(lán)色熒光蛋白的氨基酸序列和基因的核苷酸序列
②藍(lán)色熒光蛋白的功能分析和結(jié)構(gòu)設(shè)計
③藍(lán)色熒光蛋白基因的修飾（合成）
④表達(dá)出藍(lán)色熒光蛋白