胰島素作為治療糖尿病的特效藥，市場(chǎng)潛力巨大，科學(xué)家利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得轉(zhuǎn)入胰島素基因的大腸桿菌，通過(guò)發(fā)酵工程，實(shí)現(xiàn)胰島素的大量生產(chǎn)。圖1表示人胰島素基因與引物位置、限制酶作用位點(diǎn)，圖2表示所用質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)。
據(jù)圖回答以下問(wèn)題：
?
（1）若要擴(kuò)增出胰島素基因并用于表達(dá)載體的構(gòu)建，應(yīng)選擇的引物是

4

4

和

5

5

。若要得到可用于構(gòu)建表達(dá)載體的目的基因，至少經(jīng)過(guò)

3

3

次循環(huán)。
（2）構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，最好選擇限制酶

BamHI和HindⅢ

BamHI和HindⅢ

，原因是

既能防止質(zhì)粒自身環(huán)化，又可以保證目的基因正確連接在質(zhì)粒上

既能防止質(zhì)粒自身環(huán)化，又可以保證目的基因正確連接在質(zhì)粒上

。
（3）將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌時(shí)，需用

Ca²⁺

Ca²⁺

處理大腸桿菌，其目的是

使微生物細(xì)胞處于感受態(tài)，便于從外界環(huán)境吸收DNA分子

使微生物細(xì)胞處于感受態(tài)，便于從外界環(huán)境吸收DNA分子

。
（4）為了將成功導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌篩選出來(lái)，甲同學(xué)在加入氨芐青霉素的培養(yǎng)基中進(jìn)行接種，結(jié)果如圖3：
該同學(xué)采用的接種方法是

稀釋涂布平板法

稀釋涂布平板法

。乙同學(xué)認(rèn)為該結(jié)果得到的菌落并不都是成功導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌，你認(rèn)為乙同學(xué)判斷的理由是

導(dǎo)入普通質(zhì)粒質(zhì)粒的大腸桿菌也能在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)

導(dǎo)入普通質(zhì)粒質(zhì)粒的大腸桿菌也能在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)

。
請(qǐng)?jiān)诩淄瑢W(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上提出一種思路，將導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌篩選出來(lái)：

采用影印法，用無(wú)菌絨布將甲的實(shí)驗(yàn)結(jié)果影印到一個(gè)含有四環(huán)素的培養(yǎng)基B中，在甲的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中找出培養(yǎng)基B中不能生存的菌落

采用影印法，用無(wú)菌絨布將甲的實(shí)驗(yàn)結(jié)果影印到一個(gè)含有四環(huán)素的培養(yǎng)基B中，在甲的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中找出培養(yǎng)基B中不能生存的菌落

。